SEC剖析中样品吸附的改善：色谱柱的预处置惩罚

Wyeth BioPharma公司在一项要领优化与研究中发明，，，，，在对从细胞作育质料中经多步正交纯化获得的表观分子量为140 kDa的卵白质的各组分举行SEC剖析时，，，，，使用BSA（牛血清白卵白）对色谱柱举行预处置惩罚，，，，，显著提高了重现性和接纳率。。。。。

Wyeth BioPharma在三步细胞作育纯化的每个阶段都会接纳SEC剖析，，，，，以确定目的卵白中高分子量物质的纯度和接纳率。。。。。细胞作育物通过卵白A亲和层析以及后续的精制办法举行纯化。。。。。在卵白A洗脱后片断的SEC剖析中，，，，，高分子量物质区域的洗脱峰接纳率和重现性差别很大，，，，，这批注样品可能吸附在填料上。。。。。为了镌汰这种差别，，，，，实验了用BSA举行预处置惩罚的实验计划。。。。。

剖析条件

色谱柱：        TSKgel G3000SWXL（7.8 mmI.D.×30 cm, 5 μm）

流动相：        磷酸盐缓冲液（pH 6.5）

样    品：        进样量50 μL，，，，，进液50 μg

检    测：        UV@280 nm

进样量：        10 µL

结果与讨论

如图1所示，，，，，卵白A纯化样品在高分子量区域的接纳率（%HMW）仅为1.1%。。。。。在向色谱柱中注入10份、每份20 μL、浓度为5 mg/mL的BSA后，，，，，接纳率提高到了3.5%。。。。。在未举行BSA处置惩罚的情形下，，，，，从以往的数据来看，，，，，使用新色谱柱时的卵白A纯化样品的%HMW值为1.0%～1.4%，，，，，而在进样多达60次后，，，，，该值会逐渐上升至3.5%～4.0%。。。。。有趣的是，，，，，这一效果仅在卵白A纯化样品中体现显着。。。。。

图1  BSA处置惩罚前后的卵白A样品的叠加图

表1  BSA处置惩罚前后的所有三种样品的接纳率

如表1所示，，，，，BSA预处置惩罚对从下游层析办法中获得的样品没有影响。。。。。进一步的表征剖析批注，，，，，与精制后的样品相比，，，，，卵白A纯化样品中保存较高水平的宿主细胞卵白（HCP）。。。。。研究发明，，，，，这些HCP在SEC剖析图谱的HMW区域被洗脱出来。。。。。别的，，，，，当对BSA处置惩罚后的卵白A纯化样品举行SEC剖析时，，，，，发明与BSA处置惩罚前对统一样品举行SEC剖析时的效果相比，，，，，经BSA处置惩罚后的样品在HMW区域中的宿主细胞卵白含量更高。。。。。这批注，，，，，样品与色谱柱填料之间的相互作用在HCP上体现得最为普遍，，，，，而非目的分子的HMW物质。。。。。

研究结论

用BSA对SEC柱举行预处置惩罚可以镌汰二次相互作用并提高剖析间效果的一致性。。。。。在这个特定的实验计划中，，，，，与下游纯化办法（精制办法1和办法2）中HMW接纳率未受影响的情形形成比照的是，，，，，卵白A纯化组分在效果一致性方面有了显著改善，，，，，这为进一步表征卵白A纯化样品中的高分子量组分提供了契机。。。。。这一表征事情得出的结论是，，，，，对从早期纯化办法所得样品举行SEC剖析的效果，，，，，可能会受到源自细胞作育情形的非产品相关杂质的倒运影响。。。。。

参考文献

1.       Y. Kato et al; J. of Chromatrogr.404 (1987) 333-339